CRISPR基因编辑再引争议，谨慎但乐观的态度可能对投资者来说更重要
今天是2018年7月17日
农历六月初五
医麦客：CRISPR基因治疗投资需谨慎
2018年7月17日/医麦客 eMedClub/--上个月，《Nature Medicine》期刊上发表的两篇论文引起了业内热议，来自知名科研机构瑞典卡洛林斯卡研究所与剑桥诺华生物医学研究院的两个独立团队发现：经过基因编辑成功改造的细胞很可能会成为潜在的癌细胞！
文章研究结果显示，如果抑癌基因p53存在且功能健全，那么CRISPR能够激活p53引发DNA损伤，致使基因编辑失败。要么p53不存在或通路功能存在障碍，编辑成功的细胞存在癌变的风险。也就是说，癌变或者基因编辑失败？
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一时间，开发CRIPSR技术的几个公司的股票都下滑了10%左右。
然而，卡洛林斯卡那篇文章的第一作者Emma Haapaniemi在采访中表示，其研究中基于NHEJ修复机制的CRISPR-Cas9，即使在p53功能被活化的情况下也依然能够正常进行基因组编辑。
因此，CRISPR公司基于NHEJ机制的研发项目可能并不会受p53的影响。但对于一些HDR相关的研究项目却有可能会受到这些研究的影响。至于影响有多大还需要进行后续的研究才能知晓。
然而在昨天，CRISPR-Cas9基因编辑技术再引争议
最新发表在《Nature Biotechnology》上的一项新研究表明，CRISPR-Cas9技术可能导致广泛的突变和遗传损伤，其对基因组的造成的影响可能被“严重低估”。
在这项研究中，英国威康桑格研究所教授布拉德利领导的课题组首先检验了CRISPR系统在小鼠的胚胎干细胞中，对一条特定基因的编辑能力。和之前我们对CRISPR基因编辑的认知类似，靶向外显子的gRNA取得了非常好的基因敲除效果，效率达59%-97%。
然而，他们意外地发现，靶向内含子的gRNA，基因敲除的效率也不低。其中，离外显子序列较近的一些gRNA，其基因编辑效率也能达到8%-20%。更夸张的是，有两条gRNA靶向的内含子序列，距离最近的外显子有2kb的距离，它们竟也有5%-7%的编辑效率，明显高于负对照。后续的测序结果则发现，尽管这些gRNA靶向的是遥远的内含子区域，但该基因的外显子依旧会被删除。
布拉德利课题组
（第一排中间的是布拉德利教授）
总之，该研究表明，经过CRISPR-Cas9系统的编辑后出现大量的DNA碱基的删除或插入变异，而其中一些基因与初始编辑点并不相近。
这会导致巨大的影响，例如一些不正常的缺失会沉默那些本来应该活跃的基因，或者激活一些本来应该被关闭的基因（如致癌基因）。这一效应在小鼠的胚胎干细胞、小鼠的造血祖细胞和人类的分化细胞系中，都得到了类似的结果。
布拉德利教授告诉路透社说：“该研究是对治疗相关细胞中CRISPR-Cas9编辑引起的意外事件的首次系统评估。我们发现之前基因编辑引起的DNA变化被严重低估了。重要的是，这提醒我们应当谨慎使用这种技术进行基因治疗，并且要仔细检查是否存在可能的有害影响。”
这个新闻显然不是基因编辑公司想要听到的消息，特别是在先前的癌症风险警告推动其股价走低之后。在这份报告公布后，各大CRISPR公司的股价亏损还在继续，Editas 下跌了5％，CRISPR Therapeutics下跌7％，Intellia下跌了7％。
处在风口之一的Intellia公司很快就反击了这份报告
该生物技术公司表示，就该报告而言，任何内容都不是新的或特别令人担忧的。这些缺失并不是新发现的，它不太可能只在CRISPR /Cas9技术上发现，也不会显著影响基于CRISPR的疗法的前进道路。
Intellia首席创新官遗传学家Tom Barnes说：“目前，Intellia已经分析了编辑目标和数万个DNA碱基附近的附带损伤，但所有的我们已经介绍过的编辑中还没有看到这些细胞有任何的致癌转化。”
另一份声明中，Editas发言人Cristi Barnett表示：“来自CRISPR的遗传混乱的可能性是“一个有趣的话题”，该公司正在积极研究。但是，报道的DNA破坏对于我们制备基于CRISPR的药物不会造成特别大的问题。”
而CRISPR Therapeutics公司暂未进行相关评论。
（图片来源：GETTY IMAGES）
早在2012年，来自美国和奥地利的科学家共同改进了CRISPR-Cas9系统，并在其发表的研究论文中预示：CRISPR可作为一种高效而特异的RNA介导的基因编辑工具。2013年，张锋等人利用CRISPR进行哺乳动物细胞的基因编辑，开启了CRISPR作为可编程的基因编辑工具的新纪元。
利用CRISPR-Cas9技术可简单、高效的对基因组实现精确编辑，这堪称是生物学研究中的一场技术革命。理论上，CRISPR技术可以让我们随意编辑任何基因突变，并且具有治愈基因突变引起的疾病的潜力。很多人相信，基因编辑很快就能被用于临床治疗。
目前，首批推进最快的CRISPR临床试验之一正在中国开展，以测试CRISPR治疗晚期食管癌患者的潜力。在欧洲，首个CRISPR临床试验针对β-地中海贫血，由CRISPR Therapeutics和Vertex公司联合开发。而在美国，首个CRISPR临床试验将由宾大领导，将使用CRISPR技术改造免疫细胞以促使它们攻击三种不同类型的癌症。
作为CRISPR技术的领先者，美国于今年初才将其应用于人体试验，而使中国成为了首个将CRISPR技术用于人体试验的国家。可见FDA对CRISPR基因编辑技术的临床应用还是相当谨慎的。
CRISPR技术似乎存在很多的不确定性，
那么投资者应如何看待这些CRISPR公司？
当前，CRISPR/Cas9技术在生物和医疗领域可能产生的颠覆性作用受到了投资圈的追捧，海量资本涌入了相关技术的创业项目。在全球市场上，居于CRISPR领域前三的公司分别是Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics。
数据来源：各公司官网。*表示主要候选药物。
由这三家公司的研发项目可以看出：
按照使用的CRISPR技术是HDR还是NHEJ来分类适应症，三家公司的研发管线在多种疾病中使用HDR较多；
另外，如Editas Medicine和CRISPR Therapeutics，它们都有针对血液病β-地中海贫血和镰状细胞病的项目，但前者的方法需要HDR，而后者只需要NHEJ，而这个差异或许会对这三家公司的临床数据有重要的影响。
CRISPR介导的HDR和NHEJ
CRISPR-Cas9介导的DNA切割最后结果是目标DNA（PAM序列上游约3～4nt）的双链断裂（double strand break，DSB），通常会激活真核细胞内的修复机制，比如非同源末端连接（non-homologousend joining, NHEJ）和同源重组修复（homology-directed repair, HDR）。
HDR与NHEJ的机制（图片来源：ResearchGate）
利用CRISPR进行基因治疗的主要策略：
（1）有效但易错的NHEJ
NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，能快速的修复双链断裂，但通常会在双链断裂位点产生小的插入缺失。NHEJ介导的双链断裂修复的随机性具有重要的实用意义，因为Cas9和gRNA在细胞群体中的表达，将产生多种不同的突变。基因治疗中NHEJ担任的角色主要是破坏突变的致病基因或删除突变蛋白中的突变结构域。
但是可以通过直接删除致病基因的方式治疗的疾病还是占少数的，而对于大多数遗传疾病，尤其是代谢酶突变导致的疾病，基本上是不能通过直接删除致病基因的方式去治疗疾病的，需要精确的修复致病突变才能恢复疾病表型，从而达到治疗效果。因此，这就需要HDR介导的基因治疗方式来精确的修复致病基因的突变位点。
（2）低效但高保真HDR
NHEJ介导的双链断裂修复不够完美，通常会导致基因ORF阅读框的中断，HDR能用于产生特异性的核苷酸改变（也就是基因编辑），这种改变小到单核苷酸改变大到大片段插入。基因治疗中HDR担任的角色主要是人为提供正确的修复模板来精确的修复致病基因的突变位点。
然而，即使在表达Cas9、gRNA和外源性修复模板的细胞中，HDR效率通常也比较低（低于修饰等位基因的10%）。对于大多数疾病来说，它需要非常高HDR效率才可能缓解疾病表型，而目前体内HDR的效率的确非常之低。
另外，对于投资者来说，还有以下三个因素是必须要考虑的：
（1）成本：无论如何，公司可能会继续使用HDR。为此，他们可能需要实施严格的筛选方法，以确保在治疗中最终重新注入患者的细胞不含（或低于某一阈值的）癌细胞。但这将大大增加CRISPR基因编辑疗法的成本，并且需要进行非常成熟的监管审查。
（2）年龄：在生物学上，DNA修复机制对年轻的生物体更有效。这可能意味着患者的年龄对基因编辑疗法的功效能产生显著影响。
（3）NHEJ技术还需更深入的研究：依赖于NHEJ的CRISPR工具的“副作用”尚未得到具体研究，但众所周知，NHEJ修复也可能在细胞内发生故障。虽然不涉及p53，但其他突变蛋白的存在可导致遗传性疾病、卵巢癌、乳腺癌以及前列腺癌。CRISPR工具是否会触发这些错误机制的激活？风险有多大？这个方面还需要更多的研究，但最好在各个公司深入临床试验之前解决这些问题。
致投资者
近年来，关于CRISPR技术安全性的问题一出，便能引发行业内的广泛传播和热议。对于投资者而言，CRISPR技术使用的机制是HDR还是NHEJ是一方面的考虑因素。但也不必过度恐慌CRISPR导致P53丢失引起的致癌风险，因为即使p53会影响CRISPR-Cas9系统在某些类型细胞中的基因组编辑，也并不意味着所有的CRISPR疗法都存在这种问题。
而最新的研究是对CRISPR脱靶效应的一次系统研究，就该项研究而言，或许给我们带来更多的是警示，意味着需要对基因编辑后的基因组进行更加全面的分析以确保应用在基因治疗上的安全性。
目前，上述三家公司都在认真对待CRISPR与癌症的可能联系。CRISPR Therapeutics首席执行官Sam Kulkarni说，“我们需要注意这一点，特别是当CRISPR扩展到更多疾病时。”
投资者也应该采取类似的谨慎态度。虽然最新的研究并不意味着否定CRISPR，但是错误的DNA修复机制的存在可能会严重限制基因编辑工具的实际医学应用。最终，我们还是需要期待更多数据才能进一步了解CRISPR致癌风险以及其临床应用的安全性。
来源：
https://endpts.com/another-stark-warning-over-crispr-cas9s-potential-to-do-lasting-harm-dents-share-prices/
https://www.biospace.com/article/new-study-says-dna-damage-from-crispr-cas9-gene-editing-has-been-underestimated/
https://www.statnews.com/2018/07/16/crispr-potential-dna-damage-underestimated/
https://www.fool.com/investing/2018/07/03/a-deep-dive-into-the-latest-crispr-controversy-her.aspx
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